Genome Editing

CRISPRI

 

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR) TypeII system은 현재 가장 일반적으로 genome engineering에 사용되는 RNA-Guided Endonuclease Technology로 기존의 protein-based targeting (TALEN and Zinc Finger) 방식을 대체하는 새로운 시스템으로

 

짧은 RNA를 사용하여 nuclease가 DNA target을 찾도록 하는 시스템입니다. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)과 CRISPR Associated (Cas) system은 박테리아에서 발견된 외부 DNA에 대한 방어기제로 현재까지 bacterial CRISPR system으로는 세가지 타입이 밝혀져있습니다. 이 중 타입II시스템이 현재 genome engineering 기술의 기반이 된 CRISPR입니다.

이 시스템은 1) guide RNA 와 2) endonuclease (CRISPR associated (Cas) nuclease, Cas9)로 구성되어있습니다. 세포 내에서 이 Guide RNA와 Cas9이 발현되면, genomic target sequence는 modify되거나 영구적으로 손상될 수 있습니다.

gDNA/Cas9 complex는 gRNA sequence와 상보적인 genomic DNA의 target sequence과 base-pairing을 이루게 되는데 Cas9이 성공적으로 target sequence에 binding 하기 위해 genomic target sequence 바로 다음에 반드시 정확한 Protospacer Adjacent Motif (PAM) sequence가 위치해야 합니다. Cas9이 target sequence에 binding 하게 되면 DNA의 두 strands를 모두 잘라주어 Double Strand Break (DSB)를 만드는데, Cas9은 PAM sequence의 upstream 3~4 nucleotides를 자르게 됩니다. 이렇게 생성된 DSB는 두 가지 repair pathway 1) Non-Homologous End Joining (NHEJ) DNA repair pathway 2) Homology Directed Repair (HDR) pathway 중 하나로 수선됩니다.

NHEJ repair pathway는 DSB site에서 frameshifts 또는 premature stop codons등을 유도하여 inserts/deletions(InDels) 으로 인해 target gene의 open reading frame (ORF)를 을 손상시킬 수 있습니다. HDR pathway에는 DSB를 수선할 repair template가 반드시 필요합니다. HDR은 target sequence를 자르기 위해 repair template를 정확히 복사한 뒤, 특정 염기서열을 repair template와 함께 target gene에 도입시킬 수 있습니다.

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